Themistocles, de eerste Archon in het officiële jaar 493/492 v.C., vermoedde al dat de Perzen een aanval aan het voorbereiden waren en hij breidde Piraeus daarom uit tot de grootste haven van Athene. In 492 v.C. rukten de Perzen, onder bevelhebber Mardonios, op naar het eiland Thassos in Macedonië. Het jaar daarop stelden de Perzen de Griekse steden een ultimatum voor om zich te overgeven. Sommige steden deden dat, terwijl andere zich aansloten bij Sparta en Athene om de Perzen te weerstaan.

De eerste noemenswaardige militaire strijd tussen de Perzen en de Grieken begon in 490 v.C.. Onder het bevel van de Perzen Datis en Artaphenos kwam een enorm leger aan op het eiland Eritrea. Na zes dagen van belegering werd de Griekse stad uiteindelijk platgebrand en vestigde het leger er een basiskamp. Anderzijds gingen Callimachos en Miltiades, die aan het front van het Atheense leger stonden, de strijd aan in de baai van Marathon, in een kleine doorgang die naar Athene leidt.

Het Atheense leger was echter veel minder talrijk en moest de Spartanen om hulp vragen. Nadat de Perzen dit zwakke punt van hun vijanden ontdekten, besloten ze aan te vallen vóór de komst van de steun van de Spartanen. Gelukkig waren de plaatselijke omstandigheden in het voordeel van de Atheners, die erin slaagden de Perzen terug te dringen naar hun schepen. De Perzen lieten de bedroevende poging om de Atheners vanuit het westen aan te vallen varen en keerden terug naar Klein-Azië. Uiteindelijk won Athene dus de slag, en ze waren er zo trots op dat ze er steeds aan herinnerden. Na deze overwinning probeerde Athene zijn leger actief te houden en deed enkele pogingen om enkele Cycladische eilanden te veroveren.

Op politiek vlak waren de jaren rond 480 v.C. een cruciale test voor de nieuwe Cleisteense grondwet. Er waren veel gevechten om de politieke macht, veel politici werden in deze jaren (487 – 482 VC) verbannen op grond van het ostracisme. Vanaf 487 v.C. werden de 9 Archon niet meer gekozen, maar uit de 100 genomineerde Deme gehaald, waardoor de macht van de Areopagus afnam.

Een belangrijk persoon uit deze tijd was Themistocles. Hij vergrootte Piraeus tot de grootste haven van Athene en versterkte de vloot van Athene, bekend om zijn wendbaarheid en krachtige roeitactieken.